Набор для секвенирования кДНК со стадией ПЦР PCR-cDNA Sequencing Kit предназначен для секвенирования РНК через стадию синтеза кДНК с последующей ПЦР. С помощью набора PCR-cDNA Sequencing Kit можно:

• работать с ограниченным количеством стартового материала,
• оптимизировать ход эксперимента для получения максимальной производительности,
• исследовать дифференциальную экспрессию генов,
• характеризовать транскрипционные изоформы, варианты с альтернативным спласингом и фьюжн-транскрипты,
• секвенировать полноразмерные кДНК и анализировать их количество.

В состав набора входит Pro Flow Cell Priming Kit для загрузки библиотек в ячейку, совместимый с ячейками для PromethION

Особенности набора:

время пробоподготовки	от 165 минут
требуемое количество ДНК	1 нг полиА + РНК или 50 нг суммарной РНК
необходимость обратной транскрипции	да
необходимость ПЦР	да
длина рида	равна длине полных транскриптов
производительность	3 гигабазы и более за 6 часов, до 8 гигабаз и более за 48 часов
число ридов	7-12 миллионов и более полноразмерных кДНК
мультиплексирование	с PCR Barcoding Expansion Pack (SQK-PBK004)
совместимые протоколы	cDNA-PCR sequencing
количество библиотек	6
совместимость с проточными ячейками	FLO-MIN106D, FLO-PRO002 (PromethION)

Набор рассчитан на работу с минимальным количеством поли-А+ РНК, для получения библиотеки достаточно всего 1 нг. В случае невозможности выделения полиА+-фракции допустимо использование суммарной РНК (рекомендуется не менее 50 нг), но в этом случае требуется оптимизация пробоподготовки.

Пробоподготовка заключается в синтезе комплементарной цепи кДНК с помощью обратной транскрипции. Обогащение библиотеки полноразмерными копиями происходит за счёт переключения цепей при обратной транскрипции (strand-switching). Затем происходит синтез двухцепочечной кДНК с помощью ПЦР, в реакции используются специфические праймеры для последующего безлигазного присоединения сиквенсных адаптеров.
При работе с PCR-cDNA Sequencing Kit предусмотрена возможность мультиплексирования с помощью набора PCR Barcoding Expansion (SQK-PBK004). В одну библиотеку может быть загружено до 12 образцов кДНК.

Дополнительные расходные материалы и реактивы:

• магнитные частицы Agencourt AMPure XP (Beckman Coulter),
• мастер-микс для ПЦР LongAmp Taq 2x (New England Biolabs M0287),
• 1,5 мл пробирки типа Эппендорф с низкой адгезивностью DNA LoBind (Eppendorf 0030108051),
• 0,2 мл тонкостенные пробирки для ПЦР (Axygen PCR-02-C),
• вода, не содержащая нуклеаз (Thermo Fisher Scientific R0581),
• свежеприготовленный 70% этанол,
• 10 мМ раствор dNTP (Thermo Fisher Scientific R0191),
• обратная транскриптаза Maxima H Minus (Thermo Fisher Scientific EP0751),
• ингибитор РНКаз RNAseOUT (Thermo Fisher Scientific 10777019).

Дополнительное оборудование:

• настольная микроцентрифуга (например, Eppendorf 5452000018),
• вортекс (например, Biosan BS-010203-AAG),
• магнитный штатив (Диаэм 3336),
• ротационный перемешиватель (например, Elmi RM1L),
• амплификатор (например, Thermo Fisher Scientific A37834),
• набор автоматических пипеток переменного объёма - от 0.5 до 10 мкл (например, Eppendorf 3120000020), от 2 до 20 мкл (например, Eppendorf 3120000038), от 10 до 100 мкл (например, Eppendorf 3120000046), от 20 до 200 мкл (например, Eppendorf 3120000054) и от 100 до 1000 мкл (например, Eppendorf 3120000062),
• наконечники с фильтром к автоматическим пипеткам,
• термоконтейнер со льдом,
• таймер (например, TR118OS),
• охлаждающий штатив для пробирок на 0,2 мл (например, Eppendorf 3881000031).

Опционально:

• флуориметр Qubit 4.0 (Thermo Q33227),
• система для фрагментного анализа (например, Qsep 100),
• наноспектрофотометр (например, NanoDrop 2000C).