Мультиплексное секвенирование с баркодированием удобно, если количество сиквенсных данных, получаемое с одного образца, существенно меньше производительности проточной ячейки. В таком случае имеет смысл объединять образцы в одну библиотеку и секвенировать их одновременно. Это также снижает стоимость секвенирования каждого образца.

Набор PCR Barcoding Kit удобен в тех случаях, когда:

• возможно объединение до 12 образцов в общую библиотеку с целью снижения стоимости запуска секвенатора,
• исходное количество ДНК невелико,
• предполагается оптимизировать эксперимент с целью макисмального выхода,
• требуется контроль длины рида,
• секвенируется кДНК или специфические ампликоны.

Особенности набора:

время пробоподготовки	от 60 минут (без учёта стадии ПЦР)
требуемое количество ДНК	менее 100 нг двухцепочечной ДНК
необходимость ПЦР	да
фрагментация ДНК	опциональная
длина рида	равна длине ампликонов
производительность	2 гигабазы и более за 6 часов, 8 гигабаз и более за 48 часов
совместимые протоколы	PCR Barcoding Nested PCR Sequencing cDNA PCR Barcoding *
количество библиотек	6 библиотек до 12 образцов в каждой

* Полные протоколы доступны на сайте www.nanoporetech.com для зарегистрированных пользователей-участников Nanopore Community.

Набор PCR Barcoding Kit также может быть использован в сочетании с набором PCR cDNA Sequencing Kit (SQK-PCS109) для мультиплексного секвенирования кДНК.

Пробоподготовка заключается в опциональной фрагментации геномной ДНК с последующей достройкой концов, лигировании адаптеров к достроенным концам и ПЦР с праймерами, содержащими бар-коды. В состав набора входит 12 пар бар-кодированных праймеров. В конечном итоге образцы после ПЦР объединяются, и к смеси добавляются сиквенсные адаптеры.

Длины фрагментов, получаемых в ходе ПЦР, зависят от длины исходной матрицы и от процессивности ДНК-полимеразы. Максимальная длина рида составляет в среднем около 2 тыс п.н.

Пользователь также может использовать метод ПЦР с 2 парами праймеров (nested PCR), при этом одна пара праймеров - пользовательские праймеры к определённой последовательности ДНК, а вторая - бар-кодированные праймеры из набора. 5’-концы пользовательских праймеров должны быть комплементарны 3’-концам бар-кодированных праймеров.

Последовательности бар-кодов автоматически распознаются программой для интерпретации данных секвенирования, и риды группируются в соответствии с бар-кодами.

Ещё одно преимущество набора — если исходная ДНК загрязнена, то в ходе ПЦР существенно снижается концентрация примесей, которые могут ингибировать процесс получения библиотеки.

Если количество исходной ДНК менее 1 нг — рекомендуется предварительная полногеномная амплификация.

Дополнительные расходные материалы и реактивы:

• магнитные частицы Agencourt AMPure XP (Beckman Coulter),
• набор для достройки концов ДНК NEBNext End repair / dA-tailing Module (New England Biolabs E7546),
• набор для лигирования ДНК NEB Blunt/TA Ligase Master Mix (New England Biolabs M0367),
• мастер-микс для ПЦР длинных фрагментов, например, LongAmp Taq 2X Master Mix (New England Biolabs M0287),
• 1,5 мл пробирки типа Эппендорф с низкой адгезивностью DNA LoBind (Eppendorf 0030108051),
• 0,2 мл тонкостенные пробирки для ПЦР (Axygen PCR-02-C),
• вода, не содержащая нуклеаз (Thermo Fisher Scientific R0581),
• свежеприготовленный 70% этанол,
• буфер 10 мМ Трис-HCl с 50 мМ NaCl.

Опционально:

• пробирки для фрагментации ДНК Covaris g-TUBE.

Дополнительное оборудование:

• настольная микроцентрифуга (например, Eppendorf #5452000018),
• вортекс (например, Biosan BS-010203-AAG),
• магнитный штатив (Диаэм 3336),
• ротационный перемешиватель (например, Elmi RM1L),
• амплификатор (например, Thermo FS A37834),
• набор автоматических пипеток переменного объёма — от 0,5 до 10 мкл (например, Eppendorf 3120000020), от 2 до 20 мкл (например, Eppendorf 3120000038), от 10 до 100 мкл (например, Eppendorf 3120000046), от 20 до 200 мкл (например, Eppendorf 3120000054) и от 100 до 1000 мкл (например, Eppendorf 3120000062),
• наконечники с фильтром к автоматическим пипеткам,
• термоконтейнер со льдом,
• таймер (например, TR118OS).

Опционально:

• флуориметр Qubit 4.0 (Thermo Q33227),
• система для фрагментного анализа (например, Qsep 100),
• наноспектрофотометр (например, NanoDrop 2000C).